aa69套餐_46岁供卵的成功率_17Ef2_4279q_01256_T604n_两步移植法移植两个胚胎成双胞胎

【三院第三代试管】

两步移植法移植两个胚胎成双胞胎的概率还是比较低的，只有在女性子宫环境好，并且胚胎鲜胚质量好的情况下，才会成功。如果移植一个胚胎，患者的身体情况不好，会导致移植成功率不高，移植两个胚胎是为了保证至少有一个胚胎存活，所以移植两个胚胎成双胞胎的情况是不多的，并且妊娠双胎的风险也比较高。

试管婴儿移植胚胎成双胞胎的案例还是有的，只是妊娠双胎的风险很高，妊娠期间也会有很多并发症，如果胎儿情况不好或者是孕妇身体不理想，医生也会建议减胎，下面可以了解一下移植两个胚胎成双胞胎的概率：

1.一般情况下，生殖中心会做单胚胎移植，只移植一个胚胎，则发生双胞胎的几率就较低；

2.如果如果移殖2-3个胚胎，发生双胞胎甚至三胞胎的几率较高，部分双胞胎的几率只有3%-8%，有的会到30%-40%；

3.两步移植法移植两个胚胎会比单胎的几率高，但移植两个胚胎到女性体内，发生多胎妊娠的发生几率要明显高于自然妊娠，根据数据显示试管婴儿双胎妊娠的几率大概30%左右。

ELISA样本制备指南及注意事项

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定义及介绍

ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）是最基础的免疫学实验之一，其理论基础是抗原抗体的特异性反应。ELISA因其特异性强、灵敏度高、稳定性好而被广泛使用。ELISA试剂盒检测样品包括血清、血浆、细胞培养上清、灌洗液或尿液等生物样本，实验操作步骤并不繁琐，但实验完成后需要把样本检测结果OD值转化为浓度值，从而供下一步分析所用，因此样品的预处理对于后续数据处理和结果分析非常重要。

样本制备指南

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血清

全血样品于室温放置2小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20min，取上清即可检测。收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。避免使用溶血，高血脂样品

2.血浆

抗凝剂推荐使用EDTA-Na

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，样品采集后30min内于2-8℃，1000×g离心15min，取上清即可检测。

3组织匀浆/组织全蛋白

用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10min，取上清检测。

其余方法：在分析天平（AL204型）上，称量50-100mg组织样本。在样本中加入5倍质量体积的含1%PMSF的1×PBS缓冲液；并用小剪刀等工具将组织样本剪碎（尽可能小块）。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开超声破碎仪，将超声破碎仪的功率调至25%，超声时间2s，间隔时间5s，总时间2min。放入样本，冰上超声3min。视样本匀浆情况调整总时长。超声完成后，将样本放于4℃或冰上裂解30min。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

组织匀浆液或组织全蛋白中的蛋白浓度对于检测实验的影响至关重要，建议样本蛋白浓度至少1mg/mL以上，较低浓度蛋白的组织匀浆液有可能导致ELISA检测失败。

4.细胞提取液

贴壁细胞

用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5min后收集细胞；

悬浮细胞

可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每10

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个细胞中加入150-200μLPBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10min，取上清检测。注：留取20μL样本，用于后续BCA测定。

其余方法：

对于

贴壁细胞

：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。以2百万细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。

对于

悬浮细胞

：离心收集细胞，以2×10

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细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用手指轻弹悬浮细胞以充分裂解。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成（5-10）×10

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细胞/管，然后再裂解。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

5.细胞培养上清或其他生物体液

收集液体后于2-8℃，1000×g离心20min，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。注：因细胞培养基中的胎牛血清影响或其他生物体液中杂蛋白的影响，不建议进行BCA法测定样本蛋白含量。

实验细节与注意事项

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3代试管供卵

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收集血液应避免产生溶血现象。红细胞破碎，释放大量的过氧化物酶，会影响ELISA检测中的辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的酶促反应，造成检测结果的不确定性。

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样品收集后若在1周内进行检测可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(3个月内检测)，避免反复冻融。在检测前，冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。室温混匀后使用。

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试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果样品中待测物浓度过高或过低，请对样本做适当的稀释或浓缩。

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检测样本的稀释推荐多步稀释法，常规稀释检测为血清/血浆检测稀释度为2倍、20倍、200倍；细胞上清稀释度为5倍、50倍、500倍；建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度。

对于稀释倍数比较大的检测样本，参考稀释方案如下：

稀释100倍：一步稀释。取5μL样本到495μL标准品/样本稀释液内，做100倍稀释；

稀释1000倍：两步稀释。取5μL样本到95μL标准品/样本稀释液内，做20倍稀释，再取5μL 20倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释1000倍；

稀释100000倍：三步稀释。取5μL样本到195μL标准品/样本稀释液内，做40倍稀释，再取5μL 40倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释100000倍；

每步稀释时取液量不少于3μL，稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀，避免起泡。

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若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。

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若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。

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某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。

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对于组织匀浆、组织全蛋白、细胞提取液等蛋白提取样本，经BCA法测定样本蛋白含量后，建议进行蛋白浓度的统一化，避免因组织重量、细胞数、产物体积等因素造成的人为误差；例如，统一全部检测样本浓度为1-2mg/mL，进行后续的稀释和检测。

现代辅助生育技术的发展圆了不少家庭生育孩子的梦想，同时也带来不少法律乃至伦理问题，引发社会关注。例如通过试管技术获得的孩子仅与父或母一方有血缘关系，一旦男女双方离婚，孩子应该归谁？日前，江苏省宜兴市人民法院就受理了这样一起涉及试管婴儿抚养权的离婚案件，最终在法官的耐心工作下，案件顺利调解。

孙兴与妻子陈湘于2013年结婚，婚后多年未生育孩子，两人心急如焚四处求医。2016年，孙兴被查出患有不育症，无奈之下，夫妇俩商议选择由第三人提供精子、通过试管婴儿的方式生育子女。2017年8月，女儿小孙顺利出生，一家人喜出望外，对这个来之不易的“小天使”格外珍惜。然而，随着婚姻关系渐趋平淡，孙兴与陈湘产生矛盾，经常争吵不断，双方的感情日渐破裂，多次协商离婚。2020年6月份，陈湘起诉至宜兴法院要求离婚。

庭审中，双方都表示情缘已了，同意离婚，但在女儿的抚养权归属及另一方能否探视等问题上发生了严重分歧。陈湘表示，女儿跟男方没有血缘关系，是自己怀胎十月生下来的，理应由她抚养，同时为了女儿的健康成长，她不同意孙兴及其家人进行探视。孙兴也在法庭上极力争取女儿的抚养权。他认为，试管婴儿来之不易，耗费了高昂的经济成本和时间成本，自己有权争取其抚养权。且孩子出生后一直由爷爷奶奶照顾，老人与小孩之间已有了深厚的感情，不让老人照顾或者探视孩子对老人来说感情上难以接受。“自从女儿一出生，我就格外珍惜，决不会因为没有血缘关系就亏待她。”孙兴态度非常坚决。

考虑到案件的特殊性，承办法官暂时搁置了双方在法庭上的争议，转而从法理、情理两方面分别向原、被告展开调解工作。一方面，法官向陈湘释明，虽然小孩跟父亲没有遗传学上的父女关系，但在法律上应视为夫妻双方的婚生子女，父亲孙兴可以主张抚养权、探视权，即使抚养权给母亲，也应保障父亲一方相应的权利。另一方面，法官向孙兴释明，孩子由谁抚养，应当从有利于孩子健康成长的角度出发。小孩尚不满三周岁，跟随母亲生活对其更有利。同时，法官向他们指出，父母的分开是一种缘分的结束，但双方应尽最大的努力，减少对孩子的影响，让孩子健康地茁壮成长。

在法官的耐心调解下，双方最终同意各自做出让步，小孙由母亲陈湘负责抚养，父亲孙兴每月至少可以探视两次，双方握手言和。（文中当事人系化名）（江南晚报记者何小兵 通讯员蒋晨）

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